沙門(mén)菌是食源性致病菌中一個(gè)主要的屬，在各類(lèi)細(xì)菌性食物中毒事件中，沙門(mén)菌造成的食物中毒位居前列。常規(guī)的沙門(mén)菌檢測(cè)方法費(fèi)時(shí)費(fèi)力，已經(jīng)不能滿(mǎn)足食品生產(chǎn)質(zhì)量控制的要求。因此，需要開(kāi)發(fā)一種靈敏度高并且反應(yīng)迅速的方法。Notomi等開(kāi)發(fā)出一種新的恒溫核酸擴(kuò)增法—環(huán)介導(dǎo)恒溫核酸擴(kuò)增法(loop-mediated isothermal amplification of DNA，LAMP)。本研究利用DNA環(huán)介導(dǎo)恒溫核酸擴(kuò)增法對(duì)市售不同生肉來(lái)源的沙門(mén)菌進(jìn)行快速檢測(cè)，并且著重在靈敏度和特異性方面對(duì)此方法進(jìn)行驗(yàn)證，以建立的LAMP反應(yīng)條件能夠?qū)窈蟛≡⑸锏臋z測(cè)研究工作提供參考依據(jù)。
一、材料與方法
1、菌株
豬霍亂沙門(mén)菌豬霍亂亞種ATCC13312(S.ATCC13312)；其余5株沙門(mén)菌HB009，HB371，HB069，HB215，HB143分別分離自市售的生豬肉、海產(chǎn)品、生牛肉、生羊肉和雞肉。其他屬菌株共14株保藏于本實(shí)驗(yàn)室，作為沙門(mén)菌環(huán)介導(dǎo)恒溫核酸擴(kuò)增反應(yīng)特異性試驗(yàn)中的對(duì)照菌株。所有菌株均保存在質(zhì)脂雙層(LB)培養(yǎng)基中。
2、儀器及試劑
HtPot40恒溫金屬浴；PCR擴(kuò)增儀ABI2700；凝膠成像系統(tǒng)(BIO-RAD Gel Doc EQ凝膠成像系統(tǒng))。Bst大片段DNA聚合酶；甜菜堿(分析純，美國(guó)Sigma公司)；瓊脂糖以及引物合成。
3、方法
（1）LAMP反應(yīng)引物設(shè)計(jì)
以沙門(mén)菌的屬特異性基因invA為靶基因，選擇位于8 091～331之間的DNA序列作為L(zhǎng)AMP擴(kuò)增區(qū)域。將待擴(kuò)增的DNA分為6個(gè)獨(dú)立的區(qū)域，根據(jù)這6個(gè)區(qū)域分別設(shè)計(jì)LAMP反應(yīng)所需2對(duì)引物(內(nèi)引物FIP和BIP、外引物F3和B3)。FIP由F2和F1C兩部分組成，BIP由B2和B1C兩部分組成，其2個(gè)部分都能分別識(shí)別靶DNA正義鏈和反義鏈獨(dú)立區(qū)域。外引物F3和B3分別識(shí)別靶DNA上F2和B2的外側(cè)的獨(dú)立區(qū)域，F(xiàn)3序列是5′-gcaacagctacgtgatga-3′；B3序列是5′-ctctattgccggcatcatta-3′。2對(duì)引物識(shí)別靶DNA上6個(gè)獨(dú)立區(qū)域。FIP由22個(gè)堿基F1C和20個(gè)堿基F2，以及中間連接的TTTT組成，序列是5′-cttagatccccgcattgttggttttccgccacatattatcgcgat-3′；BIP由21個(gè)堿基B1C和20個(gè)堿基B2，以及中間連接的TTTT組成，序列是5′-gaccatcatgaatggtcagcattttattggcggtatttcggtcta-3′。
（2）LAMP反應(yīng)
DNA模板制備：DNA提取。LAMP反應(yīng)體系：25μl反應(yīng)混合物包括各1.6 μmol／L的FIP和BIP，各0.2 mol／L的F3和B3，1×恒溫緩沖液，1 mol／L的甜菜堿，6 mmol／L的MgSO4，1.6 mmol／L的dNTP，8 U／μl的大片斷DNA聚合酶，1 μlDNA。反應(yīng)過(guò)程：除了大片斷DNA聚合酶，將其余的試劑混合物于95反應(yīng)5 min，使DNA變性。然后迅速于冰上冷卻，并加入Bst聚合酶，將反應(yīng)物混勻，置于65恒溫金屬浴中反應(yīng)60 min，最后在80條件下反應(yīng)5 min結(jié)束反應(yīng)。LAMP產(chǎn)物檢測(cè)：肉眼觀察反應(yīng)物的外觀變化并在2％瓊脂糖凝膠上100 V電泳分離25 min，加樣量7 μl/上樣孔。凝膠置于EB中染色10 min，水洗10 min，在BIO-RAD Gel Doc EQ凝膠成像系統(tǒng)下照像檢測(cè)。
